Дослідження імунофенотипу гемопоетичних клітин

Імунофенотип — це антигенний склад клітини, що відповідає лінії розвитку та ступеню зрілості. Дослідження імунофенотипу (імунофенотипування) клітин крові або кісткового мозку є необхідними в сучасній гематологічній діагностиці. Вони виконуються за допомогою проточного цитометра, який працює за таким самим принципом, що й гематологічні аналізатори, з додатком вимірювання емісії флуоресцентного світла.

ОПИС ДОЛІДЖЕННЯвгору

1. Приготування матеріалу

Матеріалом для дослідження може бути:

1) периферична кров

2) кістковий мозок

3) спинномозкова рідина

4) рідини з порожнин тіла (напр. з плевральної порожнини, перитонеальної порожнини, зі склистого тіла)

5) лімфатичні вузли та інші щільні тканини (після попереднього приготування суспензії з окремих клітин).

З огляду на найбільшу доступність та простоту виконання, найкращим матеріалом є периферична кров та кістковий мозок, забрані на антикоагулянт (ЕДТА, гепарин) у кількості 3–5 мл (кров) або 1–2 мл (кістковий мозок). Хоча дослідження можна провести до 36 год (у випадку гепарину — навіть до 72 год) від моменту забору матеріалу, показано якнайшвидше його виконання, оскільки клітини, які зберігаються, зазнають певних змін (найсуттєвішими є: збільшення аутофлюоресценції та автоліз деяких пухлинних клітин). Ці явища можуть впливати на те, що результат тестування стане неточним або навіть помилковим і його інтерпретація виявиться неможливою. Належна температура зберігання матеріалу перед дослідженням становить 2–8° C.

Щоб зробити цитометричне вимірювання можливим, суспензію досліджуваних клітин піддають процедурі маркування, тобто поєднанню з відповідними антитілами. Набір використовуваних антитіл визначають індивідуально, залежно від аналізованої клінічної проблеми. Одні антигени виявляють при діагностиці гострого мієлоїдного лейкозу, інші — при гострому лімфобластному лейкозі, а ще інші при підозрі на неходжкінську лімфому або пароксизмальну нічну гемоглобінурію. З цієї причини діапазон виявлених антигенів слід визначати лише після морфологічної оцінки досліджуваного матеріалу та з урахуванням наявних клінічних даних.

Виявлені клітинні антигени можуть знаходитися:

1) на поверхні (найчисленніші)

2) у цитоплазмі

3) в ядрі.

Процедура виявлення поверхневих антигенів є найменш складною. Клітинну суспензію інкубують з антитілами, і після промивання клітини можна аналізувати в цитометрі. Виявлення цитоплазматичних (напр. мієлопероксидази, CD79a) або ядерних (TdT) антигенів є дещо складнішим — досліджувані клітини треба спершу «розгерметизувати», тобто утворити «пори» в клітинній мембрані, через які додані в подальшому антитіла проникають всередину клітин.

Залежно від наявних антитіл для маркування можна використовувати такі методи:

1) прямий (найпоширеніший) — якщо антитіло, що виявляє досліджуваний антиген, з’єднане з флуоресцентним барвником (флюорохромом), або

2) непрямий — до досліджуваного антигену приєднується комплементарне антитіло без флюорохрому; на наступному етапі маркування до нього приєднується антитіло другого порядку, з’єднане з флюорохромом. Оскільки всі антитіла, необхідні для проведення повної, рутинної діагностики основних груп порушень кровотворення, вже є фабрично поєднані з багатьма різними флюорохромами, непряме маркування на сьогоднішній день використовують майже виключно в наукових дослідженнях.

Використовувані антитіла — це моноклональні молекули імуноглобуліну класу IgG1, IgG2, IgG3 або IgM.

2. Аналіз в проточному цитометрі

Мічені клітини аналізуються лазерним променем, що дозволяє оцінити їх розміри, а також складність внутрішньої структури. Отримані дані представляють на цитограмі, в якій кожна точка означає одну клітину (рис. VI.C.7-1).

Діагностичне імунофенотипове дослідження зазвичай вимагає оцінки 10 000–100 000 клітин. Для пошуку популяції залишкових пухлинних клітин необхідно проаналізувати навіть 200 000–10 000 000 клітин. Точність методу дозволяє виявити 1 клітину серед 103–105 клітин.

З графіка (рис. VI.C.7-1) після вибору будь-якої популяції експресію окремих антигенів можна оцінити на основі інтенсивності флуоресценції конкретної довжини хвилі (рис. VI.C.7-2). В даний час продукуються цитометри, які оснащені 2 або 3 лазерами. Це дає змогу збирати дані про флуоресценцію, що випромінюється на кількох довжинах хвиль, завдяки чому можна виявити багато (як правило, 8–12) різних антигенів на одній клітині після інкубації з відповідною кількістю різних антитіл, кожне з яких зв'язане з іншим флюорохромом.

РЕЗУЛЬТАТИвгору

Існує декілька типів порушень імунофенотипу:

1) гіперекспресія — підвищений вміст досліджуваного антигену на клітині

2) гіпоекспресія — знижений вміст антигену, аж до його повної відсутності

3) патологічна коекспресія — наявність антигену, який не спостерігається у фізіологічних умовах на даній клітині або на певній стадії її розвитку чи функціонування.

Клітини гемопоезу містять багато різних антигенів на клітинній мембрані, у цитоплазмі та навіть в ядрі. Аналіз вмісту окремих антигенів дає змогу віднести дану клітину до певної лінії розвитку кровотворення, а також визначити, на якій стадії дозрівання чи активації вона перебуває. Під час клітинного дозрівання одні антигени поступово з’являються, а інші зникають.

Конкретний антигенний «взірець» відповідає певному ступеню зрілості клітин і становить основу для сучасної класифікації імунологічних онкологічних захворювань системи кровотворення. Майже всі антигени класифікуються в системі CD (англ. cluster of differentiation). Специфічні антитіла, які належать до різних клонів, можуть зв'язуватися з одним антигеном, а кожне з них може поєднуватися з іншим барвником. Кількість можливих комбінацій антитіло-флюорохром, що використовуються для визначення одного набору антигенів, є величезною, а отже вибір найкраще підібраного набору тестових реагентів є надзвичайно трудомістким і дорогим завданням. Тому в повсякденній діагностичній практиці все частіше використовують валідовані набори антитіл, що складаються із конкретних імуноглобулінових клонів з’єднаних з правильно підібраними флюорохромами. Такі набори можуть комплектуватися безпосередньо в цитометричних лабораторіях на основі детальних рекомендацій дослідницьких груп (напр. тих, що працюють в рамках European LeukemiaNet або консорціуму EuroFlow). Тільки чітке дотримання рекомендацій щодо налаштування та калібрування аналізаторів, а також використання перевірених панелей антитіл та валідованих діагностичних протоколів дає змогу отримати достовірні та відтворювані результати.

Гемопоетична стовбурова клітина є однією з «найбідніших» серед усіх клітин гемопоезу за вмістом антигенів. Містить зокрема найшвидше розпізнаваний антиген CD34, який наявний лише на молодих бластних клітинах, які діляться.

Гемопоетична стовбурова клітина може диференціюватися у:

1) лімфопоетичну лінію — В або Т-клітини

2) мієлопоетичну лінію — моноцити, гранулоцити, еритробласти, мегакаріоцити, мастоцити.

Кожна лінія кровотворення має характерні антигенні системи, які відрізняться залежно від ступеня зрілості клітин (рис. VI.C.7-3, рис. VI.C.7-4, рис. VI.C.7-5).

Показаннявгору

1. Гострі лейкози

1) діагностика

а) гострих мієлоїдних лейкозів — особливо важливе значення у випадку низькодиференційованих лейкозів, при яких раніше використовувані цитохімічні тести мали низьку корисність (напр. діагностика мегакаріобластного лейкозу)

б) гострих лімфобластних лейкозів (основа для їхньої класифікації)

в) лейкозів змішаного фенотипу (біфенотипових і біклональних)

г) аберантних антигенних коекспресій (наявність мієлоїдних антигенів на лімфобластних клітинах або лімфатичних антигенів на мієлоїдних клітинах)

2) оцінка прогнозу — прогностичне значення може мати, напр. виявлення аберантних коекспресій або молекул медикаментозної мультирезистентності на лейкемічних бластах, напр. CD56 на бластах при гострому мієлоїдному лейкозі з t(8; 21)

3) моніторинг величини залишкової популяції пухлинних клітин, тобто т. зв. мінімальної [або вимірюваної] залишкової хвороби (англ. minimal [or measurable] residual disease — MRD). Точне визначення вихідного, унікального імунофенотипу бластних клітин дає змогу оцінити кількість пухлинних клітин, що залишилися у пацієнта, після проведення окремих етапів лікування. Є доступні комерційно валідовані діагностичні тести для визначення MRD при гострих В-клітинних лімфобластних лейкозах (B-клітинний ГЛЛ) методом Next Generation Flow (NGF) з точністю, яка досягає 10-5, що наближається до точності дослідження методом ПЛР. Метод NGF можна застосувати у >99 % випадків B-клітинного ГЛЛ, а виявлення клітин лейкозу не залежить від знання початкового імунофенотипу клону. Виявлення MRD при гострому мієлоїдному лейкозі (ГМЛ) є складнішим, і немає готового універсального набору антитіл, який можна було б використати при кожному випадку ГМЛ. Значення MRD у конкретні моменти лікування є одним з найважливіших показників, що враховуються при плануванні подальшої терапії. Визначення MRD після завершення терапії, особливо після трансплантації стовбурових клітин кісткового мозку, має на меті якнайшвидше виявити можливий рецидив онкологічного захворювання.

2. Новоутворення зі зрілих лімфоцитів

1) діагностика хронічного лімфоцитарного лейкозу та інших лейкозів зі зрілих лімфоцитів (напр. волосатоклітинного лейкозу)

2) підтвердження клонального характеру лімфоцитозу. У випадку лінії В про онкологічне походження клітин свідчить презентація на домінуючій частині В-лімфоцитів одного типу легкого ланцюга імуноглобуліну (κ або λ). Незважаючи на те, що молекулярні методи є золотим стандартом для підтвердження клональності Т-лімфоцитів, виявлення порушень експресії кількох антигенів дає підстави припускати клональну проліферацію цих клітин. Також доступні тести для визначення підтипів β-ланцюга рецепторів Т-клітин (TCR), що дає змогу при деяких проліфераціях Т-клітин безпосередньо підтвердити клональність за допомогою проточної цитометрії.

3) оцінка прогнозу, напр. шляхом виявлення посиленої експресії антигену ZAP-70, CD49d або CD38, що ідентифікує групу хворих на хронічний лімфоцитарний лейкоз із гіршим прогнозом

4) діагностика неходжкінських лімфом — чинна класифікація лімфопроліферативних новоутворень ВООЗ значною мірою враховує імунофенотипові дані. Оцінка периферичної крові, спрямована на виявлення аномальних популяцій лімфоцитів, повинна бути розглянута при кожній підозрі на неходжкінську лімфому. Цінним доповненням до гістологічного дослідження є цитометричний аналіз матеріалу, отриманого за допомогою аспіраційної біопсії лімфовузла.

5) дослідження ураження кісткового мозку клітинами лімфоми як частини оцінки розповсюдження захворювання.

3. Мієлопроліферативні новоутворення

Імунофенотипове дослідження застосовують у випадках бластної трансформації цієї групи захворювань. У такому випадку воно дозволяє підтвердити приналежність бластних клітин до мієлопоетичної або лімфопоетичної лінії.

4. Мієлодиспластичні синдроми

При підозрі на мієлодиспластичний синдром цитометрична оцінка бластних клітин може бути корисною для ідентифікації певних імунофенотипових порушень, які свідчать про непластичну природу цих молодих клітин. Також дозріваючі форми гранулоцитарної або моноцитарної лінії можуть демонструвати зміни в експресії антигену, а також порушення розмірів або грануляцій, що може мати діагностичне значення.

Однак ці порушення не повинні бути специфічними для первинних мієлодисплазій, тому необхідні подальші дослідження для кращої стандартизації імунофенотипової методики для цієї групи захворювань.

5. Множинна мієлома (ММ)

Згідно діагностичних рекомендацій встановлення діагнозу ММ потребує виявлення клональності плазмоцитів, що є найлегшим за допомогою проточної цитометрії. Крім цього, у непластичних плазмоцитах можна виявити патології в експресія багатьох поверхневих антигенів. Проточна цитометрія має особливе значення для підтвердження досягнення «ригористичної» повної ремісії після лікування, одним із критеріїв якої є відсутність клональних плазмоцитів у кістковому мозку. У пацієнтів з MM з повною відповіддю на лікування, у клінічних дослідженнях оцінюють MRD в кістковому мозку за допомогою готового тесту на основі технології NGF — високочутливого методу (з точністю 10-5) для виявлення атипових плазмоцитів та диференціювання їх з непухлинними плазмоцитами.

6. Пароксизмальна нічна гемоглобінурія (ПНГ)

Діагноз ПНГ можна встановити на підставі виявлення при цитометричному дослідженні дефіциту або відсутності білків ліпідного «якоря», тобто глікозилфосфатидилінозитолу (GPI), що зумовлює, зокрема, відсутність білків-регуляторів активності комплементу, включаючи CD55 (англ. decay-accelerating factor — DAF) та CD59 (англ. membrane inhibitor of reactive lysis — MIRL). Однак у даний час золотим стандартом діагностики є надчутливий прямий метод, що ґрунтується на цитометричній оцінці зв'язування аеролізину, сполученого з флуоресцентним барвником (англ. fluorescein-labeled aerolysin — FLAER), із молекулами GPI на поверхні клітин ≥2 ліній, тобто лейкоцитів та еритроцитів. Чутливість тесту становить 0,1 % (розд. VI.D.6.2.4).

7. Трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин

1) проточна цитометрія — єдиний метод, що дозволяє швидко та точно визначити правильний момент виконання клітинного аферезу у донора, тобто моменту появи в периферичній крові максимальної кількість клітин CD34+, серед яких є гемопоетичні стовбурові клітини

2) оцінка кількості та життєздатності прогеніторних клітин гемопоезу, які отримує реципієнт, є необхідною умовою для безпечного виконання процедури трансплантації.