Estrategia diagnóstica de la determinación de anticuerpos antinucleares

Prueba de detección: título de anticuerpos antinucleares

Desde hace años, el estándar de oro consiste en utilizar el método de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la línea celular HEp-2 en el tamizaje. La prueba sirve para determinar el patrón de fluorescencia y evaluar el título de los ANA. También se pueden utilizar cortes de tejidos animales (principalmente hígado de mono o de rata) u otras líneas celulares. De acuerdo con los datos obtenidos de la revisión bibliográfica, al analizar muestras de suero de adultos en los laboratorios se aplica una dilución inicial de entre 1:40 y 1:160 (la mayoría de los centros optan por 1:80), y en las muestras de niños entre 1:20 y 1:40. Las recomendaciones internacionales sobre la determinación de ANA publicadas en 2014 subrayan que la realización adecuada de la valoración de ANA mediante IFI depende de los reactivos utilizados, el equipamiento del laboratorio y otras condiciones locales, lo cual sugiere que cada institución ha de fijar sus propios valores de corte para el título de ANA. En la población sana, el resultado positivo se define como un título percentil >95. Según los expertos, en los adultos sometidos a un diagnóstico de enfermedades sistémicas del tejido conectivo, el valor de corte de 1:160 es suficiente. Sin embargo, los últimos criterios de clasificación del LES, elaborados por especialistas de la EULAR/ACR y publicados en 2019, señalan que en caso de sospechar esta enfermedad, un título de ANA ≥1:80 se considera relevante. Los datos bibliográficos elaborados a partir del análisis de más de 13 000 muestras prueban que estos títulos de ANA se caracterizan por la mayor sensibilidad (98 %). También cabe resaltar que la presencia de ANA es un criterio básico que permite subclasificar al paciente. Por lo tanto, a la luz de los últimos datos, está justificado —y de hecho es imprescindible— utilizar una dilución inicial de 1:80 en las muestras de suero de adultos e informar sobre los resultados positivos al registrar la reactividad de la muestra ya con el título inicial. Se sigue debatiendo sobre cómo determinar el título de cribado para las muestras de personas <16 años. Predomina la postura de que debe ser 1:40, aunque no hay pruebas directas sobre la necesidad de establecer valores de corte distintos para las muestras de pacientes pediátricos, y algunos países (p. ej. Brasil) utilizan criterios unificados para todos los pacientes, independientemente de su edad. Utilizar títulos de tamizaje distintos en los niños responde más bien a motivos prácticos, ya que los criterios de algunas enfermedades autoinmunes (p. ej. hepatitis autoinmune) contemplan títulos de tamizaje menores. También se propone clasificar los títulos de ANA —tanto los procedentes de muestras de niños como los de adultos— en bajos (entre 1:40 y 1:80), medios (entre 1:160 y 1:320) y altos (≥1:640). Los métodos de tamizaje alternativos permitidos incluyen a las pruebas de fase sólida basadas en técnicas inmunoenzimáticas o las quimioluminiscencias con aplicación de una mezcla de antígenos altamente purificados.

Prueba de detección: patrones de fluorescencia de los anticuerpos antinucleares

De acuerdo con las recomendaciones internacionales mencionadas a partir la imagen microscópica, utilizando la línea celular HEp-2, se pueden distinguir los siguientes patrones de fluorescencia del núcleo celular y/o citoplasma:

- patrones de fluorescencia nuclear más comunes (básicos):

a) homogéneo: autoanticuerpos anti-dsDNA, antinucleosomas (anti-nucleosome antibodies: aNuA), antihistonas (anti-histone antibodies: AHA) y anti-HMG (high mobility group proteins)

b) moteado (granular):

- moteado grueso (granular grueso): p. ej. autoanticuerpos dirigidos contra RNP (aRNP: U1-snRNP), Sm (aSm: U2-6 snRNP), proteínas de la matriz celular

- moteado fino (granular fino): autoanticuerpos dirigidos contra p. ej. SS-A/Ro (aSS-A/Ro), SS-B/La (aSS-B/La), Scl-70, Mi-2 (aMi-2), Ku (aKu)

c) centromérico: autoanticuerpos dirigidos contra las proteínas del centrómero A, B, C, F (ACA)

d) nucleolar: autoanticuerpos dirigidos contra PM-Scl (aPM-Scl), ARN polimerasa I, NOR-90, RNasa P, nucleolina, URNP, U3-RNP, To/Th, fosfoproteina B23 / nucleofosmina

- patrones de fluorescencia citoplasmática más comunes (básicos):

a) difuso (patrón milky way): p. ej. autoanticuerpos dirigidos contra la proteína P ribosomal (ARPA), Jo-1 (aJo-1), treonil-tRNA sintetasa (PL-7), alanil-tRNA sintetasa (PL-12), isoleucil-tRNA sintetasa (OJ), glicil-tRNA sintetasa (EJ), partícula de reconocimiento de señal (signal recognition particle: SRP)

b) granular fino: p. ej. autoanticuerpos antimitocondrias (anti-mitochondrial antibodies: AMA)

- patrones de fluorescencia nuclear menos comunes:

a) de membrana (antes periférico): autoanticuerpos dirigidos contra las láminas A, B1, B2 y C, glicoproteína gp120, nucleoporina, receptor de la lámina B

b) granular fino denso: autoanticuerpos dirigidos contra DFS70/LEDGF-P75

c) macular (granular): típico de los autoanticuerpos dirigidos contra el antígeno nuclear de células en proliferación (proliferating cell nuclear antigen: PCNA)

d) nucleolar grumoso: autoanticuerpos antifibrilarina (U3-snRNP)

e) puntos nucleares: autoanticuerpos dirigidos contra Sp100, PML, coilina p80

f) centrosoma/centriolo: centriolo, cuerpo medio (MSA-2), enolasa, nineína, pericentrina

g) huso acromático: autoanticuerpos dirigidos contra NuMA-1/MSA-1

- patrones de fluorescencia citoplasmática menos comunes:

a) patrón ligado a la presencia de autoanticuerpos antiproteínas del citoesqueleto: p. ej. autoanticuerpos dirigidos contra tropomiosina, vimentina, actina, citoqueratina

b) aparato de Golgi: asociado a la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra las proteínas del aparato de Golgi (golginas): giantina, golgina 245, golgina 110, golgina 97, golgina 95, etc.

c) patrón granular grueso: p. ej. autoanticuerpos dirigidos contra lisosomas y peroxisomas

d) otros: p. ej. patrón anillos y bastones.

Otra clasificación de los patrones de fluorescencia de los ANA, elaborada por el International Consensus on Antinuclear Antibody Patterns (ICAP), contempla cuatro grupos (véanse: tablas):

1. resultado negativo (AC-0)

2. nuclear (AC-1 – AC-14 y AC-29)

3. citoplasmático (AC-15 – AC-23)

4. asociado al aparato mitótico (AC-24 – AC-28).

Prueba de confirmación

Esta etapa sirve para determinar la especificidad antigénica de los autoanticuerpos. Normalmente se utilizan métodos inmunológicos (inmunoenzimáticos, radioinmunológicos, quimioluminiscentes), inmunoblot y Western blot. Además, en caso de confirmar la presencia de autoanticuerpos anti-dsDNA, se puede aplicar el método de IFI usando como sustrato el parásito Crithidia luciliae. El resultado de la prueba de confirmación siempre se debe interpretar en el contexto de la prueba de detección. En casos justificados (indicación clínica relevante), esta prueba se lleva a cabo aunque la primera haya arrojado un resultado negativo. Esto puede aplicarse especialmente en los casos de sospecha de aJo-1, aSS-A/Ro y ARPA.