El inmunofenotipo es la composición de la célula según los tipos de antígenos que posee, correspondiente a su línea de desarrollo y al grado de madurez. Los estudios de inmunofenotipo (inmunofenotipificación) de las células sanguíneas o de la médula ósea son esenciales en el diagnóstico hematológico moderno. Se realizan utilizando un citómetro de flujo, que funciona según el mismo principio que los analizadores hematológicos ampliado para la medición de la emisión de luz fluorescente.
Descripción del estudioArriba
1. Preparación de la muestra
El estudio puede realizarse a partir de:
1) sangre periférica
2) médula ósea
3) líquido cefalorraquídeo
4) líquidos de las cavidades corporales (p. ej. de la cavidad pleural, la cavidad peritoneal, fluido vítreo)
5) ganglios linfáticos y otros tejidos sólidos (después de preparar una suspensión de células individuales).
Debido a la mayor disponibilidad y simplicidad de procesamiento, los mejores materiales son la sangre periférica y la médula ósea, extraídas con anticoagulante (EDTA, heparina) en una cantidad de 3-5 ml (sangre) o 1-2 ml (médula ósea). Aunque la prueba se puede llevar a cabo hasta 36 h (en el caso de la heparina, incluso hasta 72 h) después de extraer la muestra, no obstante, es recomendable realizarla lo antes posible, ya que las células almacenadas sufren ciertos cambios (predominantemente, aumento de la autofluorescencia y autólisis de algunas células neoplásicas). Estos fenómenos pueden generar resultados inexactos, o incluso falsos de la prueba y su interpretación puede resultar imposible. La temperatura adecuada para el almacenamiento de la muestra antes de empezar el procesamiento es de 2-8 oC.
Para hacer posible la medición citométrica, la suspensión de las células analizadas se somete al procedimiento de etiquetado, o sea, se combina con los anticuerpos apropiados. El conjunto de anticuerpos que se utilizan se determina individualmente, dependiendo del problema clínico que se analiza. Unos antígenos se detectan en el diagnóstico de leucemia mieloide aguda, otros en leucemia linfoblástica aguda y otros ante la sospecha de linfoma no Hodgkin o hemoglobinuria paroxística nocturna. Por esta razón, el rango de antígenos detectados solo debe determinarse después de la evaluación morfológica del material analizado y teniendo en cuenta los datos clínicos disponibles.
Los antígenos celulares que se detectan pueden estar localizados:
1) en la superficie (más numerosos)
2) en el citoplasma
3) en el núcleo.
El procedimiento para detectar antígenos de la superficie es el menos complejo. La suspensión celular se incuba con anticuerpos, y después del lavado, las células ya pueden ser analizadas en el citómetro. La detección de antígenos citoplasmáticos (p. ej. mieloperoxidasa, CD79a) o nucleares (TdT) es algo más complicada: hay que “permeabilizar” previamente las células analizadas, o sea, crear “poros” en la membrana celular, a través de los cuales los anticuerpos, que se añaden más adelante, penetran en las células.
Dependiendo del tipo de anticuerpos utilizados, se pueden usar los siguientes métodos para el etiquetado
1) directo (el más utilizado): el anticuerpo que detecta el antígeno analizado se conjuga con un compuesto fluorescente (fluorocromo), o
2) indirecto: al antígeno analizado se combina con el anticuerpo complementario sin fluorocromo y en la etapa siguiente del etiquetado, se une a un anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo. Como todos los anticuerpos necesarios para realizar un diagnóstico de rutina completo de los principales grupos de trastornos hematopoyéticos ya están conjugados con una amplia variedad de fluorocromos en forma de preparados comerciales, el etiquetado indirecto se utiliza en la actualidad casi exclusivamente en investigación científica.
Los anticuerpos utilizados son moléculas de inmunoglobulina monoclonal de clases: IgG1, IgG2, IgG3 o IgM.
2. Análisis en un citómetro de flujo
Las células etiquetadas se analizan con un rayo láser, lo que permite una evaluación de su tamaño y de la complejidad de su estructura interna. Los datos obtenidos se presentan en un citograma, en el que cada punto representa una célula (→fig. VI.C.7-1).
Para realizar los estudios inmunofenotípicos de diagnóstico, normalmente se requiere evaluar 10 000-100 000 células. Para detectar las células neoplásicas residuales, hay que analizar hasta 200 000-10 000 000 de células. La precisión del método permite detectar 1 célula entre 103-105 células.
Basándose en el esquema (→fig. VI.C.7-1) después de seleccionar una población, se puede evaluar la expresión de antígenos individuales en función de la intensidad de fluorescencia de una longitud de onda específica (→fig. VI.C.7-2). Los citómetros fabricados actualmente vienen equipados con 2 o 3 láseres. Esto hace posible la recopilación de datos de fluorescencia emitida en varias longitudes de onda, lo que permite detectar muchos (por lo general 8-12) antígenos diferentes en una célula, tras su incubación con un número apropiado de anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales está combinado con un fluorocromo diferente.
ResultadosArriba
Existen varios tipos de aberraciones inmunofenotípicas
1) hiperexpresión: incremento de la cantidad de antígeno analizado en la célula
2) hipoexpresión: reducción de la cantidad de antígeno, hasta la ausencia total
3) coexpresión aberrante: presencia de un antígeno que no aparece en condiciones fisiológicas en una célula determinada o en una fase específica de su desarrollo o fase funcional.
Las células hematopoyéticas contienen muchos antígenos diferentes en la membrana celular, en el citoplasma e incluso en el núcleo. El análisis del contenido de los antígenos individuales hace posible asignar una célula determinada a una línea específica del desarrollo hematopoyético y determinar en qué etapa de maduración o activación se encuentra. En el curso de la maduración celular, algunos antígenos aparecen gradualmente y otros desaparecen. El "patrón" antigénico determinado es específico para cada uno de los grados de madurez de la célula y constituye la base de las clasificaciones establecidas actualmente de las neoplasias inmunológicas del sistema hematopoyético. Casi todos los antígenos están clasificados en el sistema CD (cluster of differentiation). Con un antígeno pueden conjugarse los anticuerpos específicos que pertenecen a diferentes clones, y cada uno de ellos puede estar combinado con otro colorante. El número de combinaciones posibles de anticuerpos con fluorocromo que sirven para determinar un solo conjunto de antígenos es enorme, así que la elección del conjunto de reactivos de ensayo más adecuado es una tarea particularmente laboriosa y costosa. Por lo tanto, en la práctica diaria de diagnóstico se utilizan cada vez más los conjuntos de anticuerpos validados, compuestos por clones específicos de inmunoglobulinas combinados con fluorocromos adecuadamente seleccionados. Dichos kits pueden ser completados directamente en los laboratorios de citometría a base de recomendaciones detalladas de los grupos de investigación (p. ej. los que actúan en el marco de la European LeukemiaNet o del consorcio EuroFlow). Solo el cumplimiento estricto de las recomendaciones para configurar y calibrar los analizadores, y el uso de paneles verificados de anticuerpos y protocolos de diagnóstico validados permiten conseguir resultados fiables y reproducibles.
La célula madre hematopoyética es una de las células hematopoyéticas más "pobres" en términos del contenido de antígenos. Contiene, entre otros, el primer antígeno identificable: CD34, presente solo en las células blásticas jóvenes, que se dividen.
La célula madre hematopoyética puede diferenciarse en
1) línea linfoide: células B o T
2) línea mieloide: monocitos, granulocitos, eritroblastos, megacariocitos, mastocitos.
Cada línea hematopoyética posee sistemas característicos de antígenos que difieren según el grado de madurez celular (→fig. VI.C.7-3, fig. VI.C.7-4, fig. VI.C.7-5).
IndicacionesArriba
1. Leucemias agudas
1) diagnóstico de
a) leucemias mieloides agudas: particularmente importante en las leucemias poco diferenciadas, en las cuales los estudios citoquímicos previamente utilizados fueron de poca utilidad (p. ej. diagnóstico de leucemia megacarioblástica)
b) leucemias linfoblásticas agudas (básico para su clasificación)
c) leucemias de fenotipo mixto (bifenotípicas y biclonales)
d) coexpresiones antigénicas aberrantes (presencia de antígenos mieloides en células linfoblásticas o antígenos linfáticos en células mieloides)
2) evaluación del pronóstico: pueden ser de importancia pronóstica p. ej. la detección de la coexpresión aberrante o de moléculas de resistencia a múltiples medicamentos en los blastos leucémicos, p. ej. CD56 en los blastos en leucemia mieloide aguda con t(8;21)
3) monitorización del volumen de la población residual de células neoplásicas, o sea, la llamada enfermedad residual mínima (o medible) (minimal [or measurable] residual disease, MRD). La determinación precisa del inmunofenotipo inicial, único de las células blásticas, permite evaluar el recuento de las células neoplásicas que quedan en el organismo del paciente después de cada etapa del tratamiento. Hay pruebas de diagnóstico con validación comercial que determinan la MRD en las leucemias linfoblásticas agudas de las células B (ALL-B) con la técnica Next Generation Flow (NGF) con una precisión de 10–5, cercana a la precisión de una prueba con el método de PCR. El método NGF se puede utilizar en >99 % de los casos de B-ALL, y la detección de células leucémicas no depende del conocimiento del inmunofenotipo inicial del clon. La detección de la MRD en las leucemias mieloides agudas (LMA) es más compleja y no existe un kit de anticuerpos universal prefabricado que pueda utilizarse en cualquier caso de LMA. El valor de la MRD, en cada fase concreta del tratamiento, es uno de los parámetros más importantes que se toma en consideración a la hora de planificar la terapia posterior. La determinación de la MRD al terminar el tratamiento, en particular después del trasplante de células madre de la médula ósea, tiene como objetivo detectar lo antes posible la recurrencia eventual de la enfermedad neoplásica.
2. Neoplasias de linfocitos maduros
1) Diagnóstico de leucemia linfática crónica y otras leucemias de linfocitos maduros (p. ej. leucemia de células pilosas).
2) Confirmación del carácter clonal de la linfocitosis observada. En el caso de la línea B, el origen neoplásico de las células demuestra la presentación en la parte dominante de los linfocitos B de un solo tipo de cadena ligera de inmunoglobulinas (κ o λ). Aunque los métodos moleculares son el criterio de referencia para confirmar la clonalidad de los linfocitos T, la determinación de alteraciones en la expresión de varios antígenos puede sugerir la proliferación clonal de estas células. Actualmente, se dispone también de pruebas que sirven para determinar los subtipos de la cadena β del receptor de las células T (TCR), lo que permite en algunas de las proliferaciones de células T confirmar directamente la clonalidad mediante citometría de flujo.
3) Evaluación del pronóstico, p. ej. mediante la detección de una mayor expresión de antígenos ZAP-70, CD49d o CD38, lo que identifica al grupo de enfermos con leucemia linfática crónica con un peor pronóstico.
4) Diagnóstico de linfomas no Hodgkin: la clasificación actual vigente de la OMS para las neoplasias linfoproliferativas en gran medida toma en consideración las evidencias inmunofenotípicas. La evaluación de la sangre periférica para detectar poblaciones anormales de linfocitos debe considerarse ante cualquier sospecha de linfoma no Hodgkin. Un complemento valioso para el examen histológico es el análisis citométrico del material obtenido mediante el aspirado del ganglio linfático.
5) Examen de la afectación de la médula ósea por las células de un linfoma como parte de evaluación de la extensión de la enfermedad.
3. Neoplasias mieloproliferativas
El estudio inmunofenotípico es aplicable en casos de transformación blástica de este grupo de enfermedades. Permite confirmar que las células blásticas pertenecen al linaje mieloide o linfoide.
4. Síndromes mielodisplásicos
Si se sospecha el síndrome mielodisplásico, la evaluación citométrica de las células blásticas puede ser útil para identificar ciertas aberraciones inmunofenotípicas, que confirman la naturaleza neoplásica de estas células jóvenes. Asimismo, las células de la línea granulocítica o monocítica que se encuentran en el proceso de maduración pueden mostrar cambios en la expresión de los antígenos y anomalías en el tamaño o la granulación, lo que puede ser importante para el diagnóstico. Sin embargo, estos trastornos no tienen que ser específicos para las mielodisplasias primarias, por lo que se necesitan más estudios para estandarizar mejor la técnica inmunofenotípica para este grupo de enfermedades.
5. Mieloma multiple (PCM)
De acuerdo con las recomendaciones, para el diagnóstico del PCM se requiere demostrar la clonalidad de los plasmocitos. El método más fácil de hacerlo es la citometría de flujo. Además, en las células plasmáticas neoplásicas se pueden demostrar alteraciones en la expresión de muchos antígenos de superficie. La citometría de flujo es de particular importancia para confirmar una remisión "estricta" y completa después del tratamiento, ya que uno de los criterios es la ausencia de los plasmocitos clonales en la médula ósea. En los enfermos con PCM con respuesta completa al tratamiento, en los ensayos clínicos se evalúa la MRD de la médula ósea mediante una prueba que utiliza la tecnología NGF, un método altamente sensible (precisión 10–5) para detectar células plasmáticas atípicas y diferenciarlas de los plasmacitos no cancerosos.
6. Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)
El diagnóstico de la HPN se puede establecer a base del análisis citométrico, determinando la deficiencia o ausencia de proteínas de anclaje lipídico, o sea, de glicosilfosfatidilinositol (GPI), lo que provoca, entre otros, una deficiencia de proteínas que regulan la actividad del complemento, entre otras, CD55 (decay-accelerating factor, DAF) y CD59 (membrane inhibitor of reactive lysis, MIRL). Actualmente, sin embargo, el patrón de oro del diagnóstico es el método directo ultrasensible basado en la evaluación citométrica de la aglutinación de aerolisina conjugada con fluoresceína (fluorescein-labeled aerolysin, FLAER) a las moléculas GPI en la superficie de las células de ≥2 líneas, o sea, leucocitos y eritrocitos. La sensibilidad del ensayo es del 0,1 % (→cap. VI.D.6.2.4).
7. Trasplante de células madre hematopoyéticas
1) la citometría de flujo es el único método que permite la determinación rápida y precisa del momento adecuado para llevar a cabo las aféresis de las células en el donante, o sea, el momento en que aparece el recuento máximo de células CD34+ en la sangre periférica, entre las que se encuentran las células madre hematopoyéticas
2) la evaluación del recuento y la viabilidad de las células progenitoras de hematopoyesis que obtiene el receptor es un requisito previo para la realización segura del procedimiento de trasplante.
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