Діагностика бактеріальних інфекцій

Забір та види матеріалу

1. Час забору: зробіть забір під час гострого періоду інфекції, до початку антибактеріальної терапії, а якщо пацієнт вже лікується, зазначте у скеруванні, який препарат і як довго отримує, а забір зразка зробіть безпосередньо перед введенням наступної дози ЛЗ.

2. Види, методи забору і транспортування матеріалу →табл. 28.1-1.

1) мазок із слизових оболонок та ділянок із запальними змінами — зробіть забір тампоном та доставте його у лабораторію в пробірці із поживним середовищем для транспортування або консервантом, можна у сухій та стерильній пробірці;

2) біологічні рідини (ексудат, гній, спинномозкова рідина, кров, рідина з черевної порожнини) — забір зробіть шприцом, a зразки помістіть у стерильні, щільно закриті пробірки (резервуари) або — найоптимальніше — введіть безпосередньо у флакони з готовими поживними середовищами; перед забором зразка ретельно продезинфікуйте поверхню пункції. Візьміть 10–15 мл рідини з черевної порожнини, а при підозрі на анаеробне інфікування — введіть 5–10 мл цієї рідини у поживне середовище для анаеробного транспортування. Зразки <1 мл не придатні для визначеення етіологічного фактору. Рідину для діагностики бактеріальних інфекцій зберігайте при температурі +37 °С (у інкубаторі) та транспортуйте у лабораторію при кімнатній температурі (транспортування повинно тривати ≤15 хв).

3) кал (при гострій діареї зробіть забір не пізніше 3-х днів від початку захворювання; при негативному результаті повторіть забір тричі, кожні 24 год) — вдома пацієнт повинен випорожнитись у ретельно вимиту та промиту окропом посудину (напр., нічний горщик), а у лікарні безпосередньо у стерильний резервуар. Не можна забруднювати кал водою з унітазу або сечею. За допомогою шпателя, прикріпленого до кришечки спеціального стерильного резервуару для транспортування калу, потрібно взяти грудочку, величиною в грецький горіх або 2–3 мл рідкого калу. Свіжо зібраний кал (або мазок з ануса) потрібно негайно доставити в мікробіологічну лабораторію, особливо, при підозрі на інфікування паличками Shigella або Yersinia. Якщо ж ні, то зразок потрібно помістити на поживне середовище для транспортування (середовище Кері-Блейра) та зберігати, максимально, до 24 год при темп. +4 °С (холодильник). Якщо підозрюєте холеру → використовуйте для транспортування зразка спеціальне середовище для холерних вібріонів (лужна пептонна вода). Якщо шукаєте бактерії роду Vibrio, Yersinia, Aeromonas, Campylobacter чи ентерогеморагічний штам E. coli (EHEC) → завчасно повідомте про це лабораторію та зазначте цю інформацію у скеруванні. У випадку дослідження на наявність токсину С. difficile зразок можна заморозити.

4) мазок з ануса (тільки тоді, коли не вдається отримати зразок калу) — кінець стерильного тампону введіть поза зовнішній сфінктер ануса та обертальними рухами візьміть матеріал на відповідне поживне середовище для транспортування (напр., Кері-Блейра); час забору при гострій діареї та правила транспортування →вище;

5) сеча →табл. 28.1-1;

6) зразки тканин — надсилайте в стерильних, щільно закритих резервуарах без консервантів.

В кожному випадку обов'язковим є найкоротший час транспортування, a якщо це неможливо, зразки потрібно надсилати на транспортних або транспортно-культиваційних середовищах (середовища збагачення). Під час транспортування важливою є температура, при якій повинен знаходитись зразок →табл. 28.1-1.

Таблиця 28.1-1. Вид та правила забору і транспортування клінічного матеріалу для бактеріологічних досліджень
Локалізація інфекції і матеріал		Резервуар	Підготовка пацієнта	Інструкція забору	Транспортування у лабораторію	Коментар
поверхневі абсцеси (рана, виразка, пляма) гній		транспортне середовище	протріть місце забору стерильним 0,9 % NaCl, а по периферії 70 % спиртом	мазок — візьміть з глибших змінених шарів	протягом 24 год при кімнатній температурі	у випадку підозри на змішану флору (грампозитивну i грамнегативну) використайте середовище «Columbia» або агар з колістином та налідиксовою кислотою
	глибокі абсцеси гній, тканина	резервуар для анаеробів	протріть місце забору стерильним 0,9 % NaCl і 70 % спиртом	зробіть аспірацію матеріалу або візьміть периферичні тканини	протягом 24 год при кімнатній температурі	промивання вільних фрагментів та емульгація в солі
кров, кістковий мозок		рідкі середовища для посіву крові (аероби, анаероби)	дезінфекція місця пункції 70 % спиртом і йодним розчином	наберіть 5–10 мл венозної крові (закрита система, напр., Vacutainer) під час гарячки з двох судин (права і ліва кінцівка), не проводьте забору з катетера (виняток — інфікування з катетера)	протягом 2 год при кімнатній температурі, якщо час транспортування довший — інкубація при 37 °C	наберіть перед введенням антибіотика; пофарбуйте мазок за методом Грама; нетипові напрямки досліджень, напр., бруцельоз, туляремія, туберкульоз, лептоспіроз — посів на спеціальні середовища
біологічні рідини жовч, синовіальна рідина, рідина з порожнини перикарду, перитонеальна, амніотична рідина, плевральний випіт		стерильний резервуар для анаеробів, що герметично закривається	дезінфекція шкіри перед аспірацією матеріалу 70 % спиртом і йодним розчином	зробіть забір голкою для пункції або аспіраційної біопсії	негайно, при кімнатній температурі	може вимагатись: центрифугування, фільтрування, фарбування препарату
спинномозкова рідина		стерильний, що герметично закривається(підігрітий до 37 °C) та транспортно-культиваційне середовище (підігріте до 37 °C)	дезінфекція шкіри перед пункцією	на предмет туберкульозу — 5–10 мл рідини	негайно, при кімнатній температурі, якщо час транспортування довший — інкубація при 37 °C	оцініть необхідність тестів аглютинації (N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae тип b, Cryptococcus neoformans); препарат, пофарбований за Грамом та препарат, забарвлений тушшю (Cryptococcus)
	середнє вухо пунктат	стерильний, що герметично закривається, або транспортне середовище для анаеробів	промийте зовнішній слуховий хід розведеним мильним розчином	зробіть аспірацію матеріалу шприцом, використай тампон для забору матеріалу з розірваної перетинки	негайно, при кімнатній температурі	культивація в напрямку аеробної та анаеробної флори
	зовнішнє вухо мазок	транспортне середовище для аеробів	протріть шкіру стерильним 0,9 % NaCl	мазок — візьміть з зовнішнього слухового проходу	протягом 24 год, при кімнатній температурі	культивація в напрямку аеробної та анаеробної флори
	кон’юнктива звичайний мазок	транспортне середовище для аеробів		зробіть забір з обох очей тампоном, зволоженим стерильним 0,9 % NaCl	протягом 24 год, при кімнатній температурі	прицільні дослідження Chlamydia trachomatis
	рогівка мазок, зішкріб	середовища: кров'яний агар, шоколадний агар, Sabourauda, 7H10	знеболення перед забором зразка	прямий посів	негайно, при кімнатній температурі	прицільні дослідження Chlamydia trachomatis
катетери, протези, штучні клапани		стерильний, що герметично закривається		забір стерильним інструментом	протягом 12 год	судинні катетери — напівкількісний посів шляхом розкатування на пластинці
	біоптат слизової оболонки шлунка	стерильний, що герметично закривається		гастроскопія	негайно, при темп. 4 °C	H. pylori; посів зробіть негайно, нативний препарат
	кал	чистий, сухий резервуар, транспортне середовище		у випадку нестійких бактерій, помістіть кал у резервуар відразу після забору на транспортне середовище	протягом 24 год, при темп. 4 °C	рутинно на предмет: Salmonella, Shigella; прицільні дослідження: Campylobacter, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Yersinia, E. coli O157:H7 (EHEC)
уретра ♀: виділення		зволожений тампон, транспортне середовище	заберіть виділення з устя уретри	візьміть виділення після масажу стінки уретри або шляхом введення тампону в уретру на глибину 2–4 см та обертання там протягом 2 с	протягом 24 год, при кімнатній температурі	спеціальний забір матеріалу для дослідження на предмет: Chlamydia, Mycoplasma
уретра ♂: мазок		транспортне середовище		тампон, як вище	протягом 24 год, при кімнатній температурі	як вище; інколи показаний попередній масаж простати per rectum
простата секрет		транспортне середовище або стерильний резервуар	помийте головку милом і водою	зробіть забір тампоном або петлею в резервуар	на транспортному середовищі — протягом 24 год, при кімнатній температурі; якщо у резервуарі — негайно, при кімнатній температурі	як вище
сеча		стерильний, що герметично закривається (можна посіяти на середовище Uromedium або Uricult перед надсиланням у лабораторію)	♀: помийте шкіру водою і милом, розведіть великі статеві губи ♂: помийте головку водою з милом, відведіть крайню плоть	наберіть кілька мл з середньої порції	протягом 4 год, при темп. 4 °C (посіятина середовище Uromedium чи Uricult — при кімнатній темп. протягом 24 год)	якісний та кількісний посів
	катетеризація	стерильний, що герметично закривається	помийте устя уретри водою з милом	введіть катетер у сечовий міхур, випустіть перші 15 мл, зробіть забір сечі	як вище	як вище
	надлобкова пункція	стерильний, що герметично закривається	дезінфекція шкіри у місці пункції	зробіть забір голкою, з повного міхура через стінку черевної порожнини	негайно, при кімнатній температурі	як вище
дихальні шляхи
	змиви (бронхіальні, бронхо-альвеолярні), біоптати	стерильний, що герметично закривається			протягом 24 год, при кімнатній темп. (транспортне середовище) або протягом 3 год без середовища	посів змивів на анаероби тільки при заборі катетером; важливі напрямки досліджень: Legionella, Nocardia, мікобактерії, а також Pneumocystis, CMV
	аспіраційний матеріал з бронхів	стерильний, що герметично закривається		методом щіточки (браш біопсія)	як вище	як вище
	харкотиння, бронхіальний секрет	стерильний, що герметично закривається	харкотиння: прополоскати ротову порожнину водою перед забором матеріалу, проведіть інструктаж пацієнта щодо різниці між харкотинням і слиною	матеріал отримують внаслідок глибокого кашлю та відхаркування; макроскопічна та мікроскопічна оцінка зразка	як вище	як вище
	ніс, горло мазок	транспортне середовище		введіть гнучкий тампон через ніс у носоглотку і покрутіть 5 с; матеріал, характерний для B. pertussis	протягом 24 год, при кімнатній температурі	важливі напрямки досліджень (інші методи забору): C. diphteriae, B. pertussis, Chlamydia i Mycoplasma
	горло мазок	транспортне середовище		зробіть мазок із задньої стінки горла та з мигдаликів	протягом 24 год, при кімнатній температурі	важливі напрямки досліджень: S. pyogenes (стрептококи групи A), C. diphteriae i N. gonorrhoeae
	біляносові пазухи секрет	стерильний, що герметично закривається,або транспортне середовище для анаеробів		спунктуйте пазухи, проведіть забір матеріалу шприцом	негайно, при кімнатній температурі	посів на предмет аеробів та анаеробів
кістки		стерильний, що герметично закривається	дезінфекція шкіри	зробіть забір зразка з інфікованого місця	негайно, при кімнатній температурі	можливо буде потрібна гомогенізація
тканини		транспортне середовище для анаеробів або стерильний резервуар	дезінфекція шкіри	не допускайте висихання зразка; якщо немає крові, зволожте стерильним 0,9 % NaCl	протягом 24 год, при кімнатній температурі	можливо буде потрібна гомогенізація

Методи ідентифікації бактерій

1. Мікроскопічне дослідження: основний діагностичний метод виявлення мікроорганізмів у спеціально пофарбованих препаратах тканин (напр., Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis); первинна оцінка мікроорганізмів у зразках, котрі потрібно досліджувати дуже швидко (напр., первинна ідентифікація мікроорганізмів у біологічних рідинах і в гної); нативні препарати також придатні для первинної оцінки наявності мікроорганізмів, які повільно ростуть (напр., препарати, приготовані із зразків, для дослідження на предмет туберкульозу або актиномікозу, і мікроорганівзмів, які не ростуть in vitro). Час отримання результату — 2–8 год.

2. Культивація, ізоляція, ідентифікація та визначення чутливості до антибіотиків: тривалість рутинного мікробіологічного дослідження (ізоляція, ідентифікація та виконання антибіотикограми) у випадку бактерій, які швидко ростуть, становить 24–72 год, а повільно — 4–14 днів.

3. Виявлення антигенів: використовують серологічні методи — реакція пасивної гемаглютинації чи латекс-аглютинації, імунофлюорисцентні, імуноферментні (ІФА). Перевагою є швидке отримання результату, недоліком — обмежений діапазон ідентифікації. Ці методи найбільш ефективні у випадках прицільної діагностики (напр., виявлення антигенів Chlamydia, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae типу b).

4. Виявлення антитіл: в ситуації, коли виникають труднощі із культивуванням мікроорганізмів та визначенням антигенів, використовують серологічні методи, які виявляють антитіла: пряму і непряму аглютинацію, імунодифузію, імунопреципітацію, імуноелектрофорез, імуноферментні методи, імунофлюоресцентні методи, імуноблотинг. Використовуючи серологічні методи, можна швидко встановити діагноз, визначити клас антитіл (IgM, IgA, IgG) та оцінити динаміку інфекції.

5. Молекулярні методи:

1) виявлення відомим генетичним зразком гомологічної до нього нуклеїнової кислоти (гібридизація, ПЛР, ЗТ-ПЛР). Переваги: виявлення нуклеїнової кислоти мікроорганізму є найдостовірнішим критерієм ідентифікації, результат можна одержати протягом кількох годин, можливість виявляти гени стійкості. Недоліки: важко доступні, не можуть застосовуватись для діагностики клінічних матеріалів з великою різноманітністю мікроорганізмів, дороговартісні, не дають інформації чи виявлений генетичний матеріал походить з живого чи мертвого мікроорганізму, чи це лише результат забруднення, для багатьох патогенів немає відповідних доступних комерційних тестів.

2) ідентифікація на основі аналізу рибосомних білків — масс-спектрометрія MALDI-TOF.

6. Оцінка чутливості до ЛЗ:

1) дифузійні методи — диско-дифузійний метод (дозволяє визначити чутливість або стійкість ізоляту до антибіотику), метод дифузії з використанням смужок, просочених антибіотиками, що містять розмітку із градієнтом концентрацій (раніше Е-тести) дозволяє також визначити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) антибіотика;

2) метод серійних розведень — дозволяє оцінити чутливість до ЛЗ, МІК та мінімальну бактерицидну концентрацію (МБцК).

Крім чутливості ізоляту до антибіотиків, лабораторія повинна визначити механізми резистентності: стійкість стафілококів до метициліну, продукцію β-лактамаз з вузьким спектром субстрату, продукцію грамнегативними паличками β-лактамаз з розширеним спектром субстратів (ESBL), продукцію грамнегативними паличками β- лактамаз, які розкладають карбапенеми (KPC, MBL, OXA-48), резистентність ентерококів до високої концентрації аміноглікозидів (штами HLAR) та стійкість до глікопептидів (VRE), стійкість до макролідів, лінкозамідів та стрептограміну (тип MLSB). Дослідження чутливості до ЛЗ, схоже як і проведення ідентифікації штамів, все частіше виконується за допомогою автоматичних систем.